单细胞植物研究应用:拟南芥营养期茎尖组织的发育分化

文章题目A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex

发表杂志Developmental Cell

影响因子12.54

发表时间2021.03.15

研究背景

在植物的整个生命周期中,茎端分生组织能反复地形成新的空中结构(www.7zc.net)。本文利用单细胞RNA 测序技术,在转录组水平上对拟南芥营养茎端进行了细胞分类。研究发现,茎端由高度异质性的细胞组成,这些细胞可分为7个细胞类群(cell population)和23个细胞簇(cell cluster)。作者描绘了表皮细胞、维管组织和叶肉细胞的细胞周期连续性和发育轨迹,,并推断与细胞命运决定相关的转录因子和基因表达特征。对茎和根尖细胞群体的综合分析进一步揭示了表皮和维管组织的共同而独特的特征。本文的结果为研究单细胞分辨率下植物细胞分裂和分化的基本原理提供了宝贵的资源。

原生质体制备方法

分别从7 日龄的种子幼芽,14日龄植物和18日龄植物的第三叶(叶)中收获茎尖。将茎尖在无RNase的酶溶液(1.5% cellulase R101.5% macerozyme R100.4 M mannitol0.1 M 4-morpholineethanesulfonic acid10 mM KCl10 mM CaCl2and 0.1% BSA) 中室温消化2h。为了提高酶消化效率并增强原生质体的释放,在原生质体形成过程中使用注射器针头轻轻解剖茎尖。用40μm细胞过滤器将原生质体过滤3-4次浓缩,并在室温下用8%的甘露醇洗涤3-4次。通过台盼蓝染色确定原生质体的活力,每个样品存活细胞的比例要达到85%以上。原生质体悬浮液通过血球计数板计数,最终将原生质体的浓度调整为1,500--2,000个细胞/ mL

结果

1.拟南芥营养枝顶端细胞图谱的生成

营养茎端由SAM 和叶原基组成,深嵌在茎尖内(1C)作者36643 个茎尖和叶片的细胞中发现了23个不同的clusters(1A)。对每个cluster进行GO注释。使用UMAP算法、t-SNE3D散点图分析,共分为7个细胞群:叶肉细胞(MC)、表皮细胞(EC)、茎分生细胞(SMC)、增殖细胞(PC)、维管细胞(VC)、保卫细胞(GC)和同伴细胞(CC)(1C-1E)根据 marker基因的鉴定( 1B 2),MC 种群由clusters 03416组成(图1AEC 细胞群(即L1层)包含clusters 2121418SMC 细胞群由clusters 113组成(图1A我们将clusters 5 91719注释为PC群体Clusters 6 71022被注释为VC群体(图1AGC CC种群分别是cluster 1115(图1A)。因此,营养茎端是由高度异质细胞组成的。

1. 营养茎尖中的细胞异质性

2.Marker基因的表达

2. 表皮、叶肉和维管组织中的细胞周期连续性

EC群体( L1层)进行 重新聚类分析发现,4 个亚细胞簇E3E7E8E9呈循环排列(3A) 根据细胞周期不同时期的 marker基因分析, cluster E3 被指定为SCluster E9G2 M cluster E7cluster E8 归入G0G1(图3D。通过分析显示,属于这四个clusters 的细胞形成了一个完整的细胞周期,关键的细胞周期基因在不同的细胞周期状态下表达(3G-3J)

同时对叶肉(L2 )和维管组织(L3)的细胞群进行分析但没有得到与EC 群体类似的细胞周期簇表明这两个群体的分裂细胞群可能存在于PC 群体中。根据它们的转录组特征,我们将cluster5 cluster9 分成两个子cluster(cluster 5a5b;cluster 9a9b)EC群体分析方法一致, Clusters 17 5a9a与光合作用相关,clusters 195b9b与维管组织相关。这一发现表明,PC 群体主要由两个分裂的细胞群体组成,导致了叶肉细胞和维管组织的分化。为了描绘它们的发育轨迹,将clusters 5a 9a17的细胞与VC群体分类,命名为reMC重构MC ),将clusters 5b 9b19簇的细胞与MC群体分类,命名为reVC重构VC )。在这两个重构的种群中检测到了完整的细胞周期( 3B 3C 3E 3F)EC reMCreVC群体中处于每种细胞周期状态的细胞比例是相当的(3K)

3. 营养茎尖中过渡扩增细胞的细胞周期连续性

3. 表皮细胞向气孔分化的连续性

气孔是由拟分生组织母细胞通过细胞分裂和细胞命运的顺序决定而形成的( 4A)。将相应的转运扩增亚细胞簇分为分裂亚细胞簇(E3, E7, E8, E9)和分化亚细胞簇(E8, E1, E11)(3A)。早期气孔基因如POLARSPCHBASLTMMEPF2的表达与细胞周期的进程密切相关( 4B4C)。通过对EC种群分析,clusters E1E8E9的细胞排序显示了气孔的后期分化轨迹(图4D)。控制这些细胞命运转变的关键转录因子包括MUTEFAMAEPF1MYB60沿细胞分化轨迹依次表达(图4E )。揭示了气孔发育过程中转录因子和细胞间信号分子的时空调控并描述了表皮细胞向气孔分化的连续性。

4.向气孔分化的连续的表皮细胞

4. 单细胞分辨率下的茎尖和根尖组织之间的比较

60099 个细胞的根和茎的scRNA-seq数据集进行联合分析,得到了27个全景细胞簇(P0P26)(图5A )。大多数细胞簇对于茎或根都具有特异性(5B) Cluster P22GC细胞为主,根细胞占27%。对簇中富含P22的基因进行分析后发现,HSP基因的转录水平较高,这表明某些根细胞与保卫细胞的转录组相似,这可能是由于对环境条件具有相同的过敏性。因此,我们将群集P22 注释为GC/HSP+

茎尖和根尖共享六个维管组织细胞簇(图5B )。这些共享的维管簇被分为14个亚细胞簇,从I0I13(5C) Cluster I11I12,分别对根和茎有特异性(5D) 。早期的研究表明,NPF3.1只在气生维管组织中表达,但RNA 原位杂交分析显示,NPF3.1在叶肉细胞和维管束周围的一层细胞中表达( 5E 5F) GO分析进一步表明cluster I12显示了光合作用的基因特征(5G) Cluster I12由束鞘细胞组成,在碳氮吸收协调中起着重要作用。茎表皮细胞(P3 P23P24)与根表皮细胞(P14 P20)没有重叠(5A) 。但气生表皮标记基因ATML1也在根尖的表皮细胞中表达( 5H 5I) 。此外,一组参与表皮表皮生物合成的基因,在茎和根得细胞中共表达(5J) 。在主根尖端和出现的侧根中存在一种角质层状的细胞壁结构。事实上,ATML1的表达域与氟醇黄(FY) 染色显示的主、侧根尖脂肪族聚酯沉积在时空上存在重叠(5K) 。综上所述,上述结果揭示了以前未发现的茎和根表皮之间的相似性,并描述了ATML1在根表皮细胞分化中的作用。

图5.单细胞分辨率下茎尖和根尖细胞数量的比较

结论

本文在单细胞分辨率下生成了营养茎尖的基因表达图谱,将植物茎尖分生组织的研究由传统的组织器官水平提升到单细胞水平。基于独特的转录组对营养性茎尖分生组织的不同层和功能区中的细胞进行定义,为研究人员提供了机会,以前所未有的分辨率研究茎尖分生组织的维持方式,干细胞如何通过过渡扩增细胞分化为不同的细胞类型,以及每个细胞如何与其相邻细胞联系。作者建立了相关单细胞转录组的数据库,有利于检索基因表达模式、深入挖掘参与植物细胞分裂和分化的基因。同时,本文为研究农作物细胞分化和侧枝器官形成提供了一种研究策略。

文:木槿

排版:市场部

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